Genetic Engineering for Revealing Underlying Mechanisms of Inflammatory Bowel Diseases

Abstract

Inflammatorisk tarmsykdom, også kalt IBD, er en samlebetegnelse på kronisk betennelse i tarmen. IBD består i hovedsak av ulcerøs kolitt og Crohns sykdom. De underliggende årsakene er i stor grad ukjent, men både genetikk, miljøfaktorer og tarmflora spiller inn i sykdomsdannelsen. Forekomsten av IBD øker globalt, både i vestlige land og utviklingsland. Det finnes ingen kur mot IBD, og medisinsk behandling kan kun opprettholde remisjon og lette symptomer. En dypere innsikt i årsakene og de molekylære mekanismene underlagt IBD-patologi er avgjørende for utvikling av nye behandlingsalternativer, samt medisinsk oppfølging tilpasset hver enkelt pasient.

Organoider eller “mini-tarmer” er cellemodeller utviklet det siste tiåret. Stamceller hentet fra pasientprøver kan isoleres og dyrkes til multicellulære 3D-strukturer. Sammenliknet med kreftcellelinjer, er organoider mer komplekse cellemodeller som i større grad kan etterlikne arkitekturen og sammensetning av celler sett in vivo hos pasienter. Genredigering, som ved hjelp av CRISPR/Cas9, kan i sammen med organoid-kultur ha stort potensiale for å avdekke funksjonen til gener viktig i sykdomssammenheng. Organoider er imidlertid svært vanskelig å manipulere, og det er et behov for standardiserte prosedyrer for genredigering av disse cellene. Lipocalin-2 (LCN2) er et gen kraftig oppregulert ved aktiv IBD. Det er kjent som et antimikrobielt peptid og akutt-fase protein som beskytter verten mot luminale antigener. LCN2 er videre rapportert involvert i prosesser slik som celledeling, migrasjon og dannelse av celleforbindelser. LCN2s rolle i disse prosessene er omstridt.

Hovedmålet for denne masteroppgaven var å etablere en funksjonell og standardisert prosedyre for genredigering i pasient-deriverte organoider, mer spesifikt å etablere en LCN2 knockout cellelinje. Kreftcellelinjen HT-29 ble brukt i innledende forsøk for testing av metoder, før metodedesign så ble anvendt på organoid-kultur. Elektroporering, liposomal transfeksjon og lentiviral transduksjon ble evaluert for effektivitet av genopptak og inkorporering av nukleinsyrer. Disse metodene ble testet med fluorescerende plasmider, siRNA, CRISPR-plasmider og CRISPR-Lentivirus for etablering av GFP-fluorescerende- eller LCN2-depriverte celler.

Elektroporering førte til redusert levedyktighet hos cellene, samt lav transfeksjonseffektivitet. Liposomal transfeksjon var derimot velfungerende for plasmid-opptak i HT-29 kreftceller. Med mål om å øke effektiviteten av liposomal transfeksjon i organoider, ble ulike eksperimentelle variabler slik som fravær av Matrigel, FCS tilskudd og reagens-konsentrasjoner evaluert. Til tross for forbedringer viste både elektroporering og liposomal transfeksjon seg å ha lav effektivitet i organoider. Vi oppnådde heller ikke suksess med siRNA knockdown i organoidene. Evaluering av disse ulike metodene demonstrerte lentiviral transduksjon som den mest effektive, basert på eGFP uttrykk og western blot analyser av Cas9-transduserte HT-29 celler. Disse resultatene antyder at transduksjon kan være den mest effektive metoden for genredigering også i organoider. Dette gjenstår å undersøke.

Til tross for at vi ikke lyktes med å etablere en stabil organoid- eller HT-29 KO cellelinje, har vi evaluert effekten av LCN2-fravær i HT-29 celler. xCELLigence ble brukt for å vurdere LCN2 sin rolle i celledeling, migrasjon og celleadhesjon. xCELLigence måler cellular impedans og ble brukt for målinger av HT-29 celler transfektert med enten LCN2- eller scramble siRNA. Våre resultater viste en økt cellespredning eller celledeling i LCN2-depriverte celler. Sett i sammenheng med tidligere funn, kan det tyde på at LCN2 ikke er en positiv regulator av celledeling i seg selv, men heller involvert i vevsorganisering og dannelse av celleforbindelser. Dette bør undersøkes i framtidige studier. Videre bør etablering av LCN2 KO organoider følges opp, da dette vil være et verdifullt redskap for å avdekke LCN2 sin rolle i vekst og differensieringsprosesser.

IBD is a group of chronic, inflammatory disorders affecting the gastrointestinal tract. It consists primarily of the diseases ulcerative colitis and Crohn’s disease. The underlying mechanisms are still largely unknown. However, it is accepted that the etiology is inflicted by genetics, environmental factors and microbial dysbiosis. The prevalence is increasing world-wide, both in developed and developing countries. IBD is considered as an incurable disease, and the current treatments are merely maintaining remission and relief of symptoms. Deeper insight into the causes and molecular mechanisms of IBD pathology are demanded for development of new treatment options and for targeting the disease in the individual patient with higher precision.

Organoid culture has emerged as a complex and disease-relevant research model the last decade. Stem cells derived from patient biopsies can be cultured and lead to establishment of 3D “mini-organs”. Compared to cancer cell lines, intestinal organoids can to a greater extent resemble the in vivo composition of epithelial cells. Organoid cultures have great potential in disease modeling and discovery of gene functions by utilizing gene editing tools, such as CRISPR/Cas9 technology. However, organoids are difficult to manipulate, and development of standardized protocols are required. Lipocalin-2 (LCN2) is a gene highly upregulated in active IBD. It is described as an antimicrobial peptide and acute phase protein mediating host resistance towards luminal antigens. However, its contribution as a positive or negative mediator in the events of proliferation, migration and cell junction formation remains controversial.

In the current thesis, our main aim was to establish a functional and standardized procedure for gene editing in patient derived colonic organoids, more specifically we focused on the establishment of a stable LCN2 KO cell line. HT-29 cancer cell line was used for initial experiments to establish a method which could later be applied on intestinal organoids. Gene delivery strategies such as electroporation, lipofection and lentiviral transduction were evaluated for their potential in meditating efficient transfection of nucleic acids. Furthermore, we tested transient fluorescent plasmids, siRNAs, CRISPR-plasmids and -lentiviral particles for generation of GFP-fluorescent- and LCN2-depleted cells.

Electroporation resulted in both reduced cell viability and low transfection efficiency, while lipofection on the other hand, enabled plasmid delivery in cancer cells. To improve liposomal transfection of organoids we evaluated different experimental parameters, such as disruption of the Matrigel, reagent concentrations and FCS supplementation. Despite improvements, gene editing of organoids through electroporation and liposomal transfection remained challenging. siRNA knockdown in organoids did also not result in satisfactory results. Evaluation of these methods demonstrated lentiviral transduction as the most efficient, based on eGFP expression and western blot analysis of Cas9-transduced HT-29 cells. These results suggest that lentiviral transduction could be a more efficient gene editing strategy for organoids. However, viral transduction of organoids remains to be evaluated.

Even though we did not succeed in establishing a stable organoid or HT-29 KO cell line, we evaluated the effect of siRNA depletion of LCN2 on proliferation, migration and cell adhesion. xCELLigence, a technology measuring cellular impedance, was used to analyze HT-29 cells transfected with LCN2- or scramble siRNA. Results showed an increased cell spreading or proliferation in cells depleted of LCN2. Seen together with previous findings, these results suggest that LCN2 may not be a positive regulator of proliferation itself, but rather involved in cellular organization and cell junction formation. This should be explored in future research. Furthermore, the establishment of LCN2 KO organoids should be further pursued as this would be a valuable tool in examination of LCN2’s role upon growth and differentiation processes.