Astrocyte-Neuron Interactions in Experimental Mesial Temporal Lobe Epilepsy: A study of underlying mechanisms and possible biomarkers of epileptogenesis

Abstract

Mesial temporallapps-epilepsi (MTLE) er en av de vanligste og også en av de mest terapiresistente epilepsitypene vi har. De bakenforliggende årsakene for MTLE er ikke kjent, men det er mye som taler for at forstyrret samspill mellom astrocytter og nevroner når det gjelder nevrotransmitter- og vannhomeostase kan være involvert. Om disse endringene er en årsak til – eller en konsekvens av langvarig epilepsi, altså om de er epileptogene eller ikke, er ikke kjent. I denne avhandlingen ville vi undersøkt basale mekansismer for epileptogenese og kronisk epilepsi, og samtidig se om vi kunne finne biomarkører for disse. Dette gjorde vi ved å ta i bruk kainsyre-modellen for MTLE og studere dyrene både før (i latentfasen) og etter de fikk epileptiske anfall (i kronisk fase).

13C og 1H magnetisk resonans spektroskopi (MRS) kan brukes til å måle konsentrasjonen av ulike metabolitter, samt følge metabolske baner i nevroner og astrocytter. Etter en systemisk injeksjon av [1-13C]glukose, fant vi at bade glutamat-konsentrasjonen og prosentandelen innmerket med [4-13C]glutamat var redusert i hippocampus til dyrene i kronisk fase, noe som tyder på at de gjenværende glutamaterge nevronene har nedsatt glutamat-metabolisme. I latentfasen var 13C-innmerkningen i glutamat, glutamin og GABA fra både [1-13C]glukose and [1,2-13C]acetat nedsatt i alle de undersøkte hjerneområdene. Dette tyder på at både nevronenes og astrocyttenes metabolisme er betydelig nedsatt. En lav GABA-konsentrasjon var sett kun i hippocapus, sammen med redusert [1,2-13C]GABA som stammer fra astrocyttene og en nedsatt overføring av glutamin til GABA-syntese. Dette er tegn på at astrocytter kan spille en rolle i den epileptogene prosessen i denne dyremodellen.

Sentrale enzymer i glutamat-metabolismen, glutamin synthetase (GS) og glutamat dehydrogenase (GDH), ble studert i hippocampus ved Western blotting og immunhistokjemi. GDH forble uforandret både latent- og kronisk fase. GS viste en initial økning i latentfasen, parallelt med astrogliosen og økning i glial fibrillary acidic protein, GFAP. Det tilkom en sekundær nedgang i GS utover i kronisk fase, som ikke var ledsaget av noe GFAP-tap. Dette kan tyde på at GS kan påvirke progresjonen av sykdommen.

Vi studerte også ekspresjonen og distribusjonen av den astrocyttiske vannkanalen aquaporin-4 (AQP4) i kainsyre-indusert epileptogenese. Immunogull-elektronmikroskopisk analyse viste et tap av perivaskulær AQP4 både før og etter kronisk epilepsi. Sammen med en økning i AQP4 i den aktive neuropil-delen, tyder dette på at AQP4 er feil-lokalisert, noe som kan bidra til epileptogenese via forstyrret vann- og kalium-homeostase.

På leting etter en biomarkør for epileptogenese, brukte vi mangan-forsterket magnetisk resonans imaging (MEMRI) og undersøkte dyrene fra tidlig fase (to dager) etter kainsyreinjeksjon og helt til kronisk fase. I den mesiale temporallapp var MEMRI-signalet redusert i tidlig fase, mens det delvis normaliserte seg i latent- og kronisk fase, utenom i CA1. En økning i MEMRI-signalet ble sett i entorinal cortex og amygdala i kronisk fase. Endringer i MEMRI-signalet reflekterer sannsynligvis en rekke ulike prosesser, inkludert nevronal aktivitet, og studien viste at MEMRI gir utmerket kontrast i de områdene som er sentrale for epileptogenese.

Alt i alt viser studiene våre at astrocyttenes homeostatiske funskjoner er forstyrret allerede i epileptogenesen i denne dyremodellen for MTLE. I tillegg kan nedsatt glutamatomsetning målt med 13C MRS potensielt vise seg å kunne bli brukt som en biomarkør på epileptogenese i fremtiden. Flere studier må gjøres for å avklare dette.

Mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is one of the most common and also one of the most therapy resistant types of epilepsy. The underlying causes of MTLE are incompletely understood, but there is increasing evidence that perturbed astrocyte-neuron interactions in neurotransmitter and water homeostasis play essential roles. Whether these changes are causes or consequences of long-standing epilepsy, i.e. whether they are epileptogenic or not, is not known. In the present thesis we aimed at investigating basic mechanisms underlying epileptogenesis and chronic seizure propensity in MTLE, as well as identifying possible biomarkers thereof. This was addressed using the kainate model of MTLE, studying animals prior to (in the latent phase) and after the onset of epilepsy (in the chronic phase).

13C and 1H magnetic resonance spectroscopy (MRS) can be used to measure concentrations of metabolites and track metabolic pathways in neurons and astrocytes. Following systemic injection of [1-13C]glucose we found that both the glutamate concentration and the percent enrichment with [4-13C]glutamate were reduced in the hippocampal formation of animals in the chronic phase of kainate-induced epilepsy, suggesting impaired glutamate metabolism in the remaining glutamatergic neurons. In all brain regions in the latent phase of the kainate model, 13C enrichment from both [1- 13C]glucose and [1,2-13C]acetate into glutamate, glutamine and GABA was decreased, indicating pronounced impairments of both neuronal and astrocytic metabolism. Decreased GABA content was specific for the hippocampal formation, together with a pronounced decrease in astrocyte-derived [1,2-13C]GABA and a decreased transfer of glutamine for the synthesis of GABA. The findings suggest that astrocytes may play a part in the epileptogenic process in this model.

Key enzymes in glutamate metabolism, glutamine synthetase (GS) and glutamate dehydrogenase (GDH), were studied by Western blotting and immunocytochemistry. GDH remained unchanged in both phases, while in the latent phase we found an initial increase in GS that parallelled astrogliosis and the increase in GFAP. When moving to the chronic phase, there was a secondary decrease in GS that was not accompanied by a similar loss of GFAP, suggesting a possible role in progression of the disease.

Then, we investigated the expression and distribution of the astrocytic water channel aquaporin-4 (AQP4) during kainate-induced epileptogenesis. Immunogold electron microscopic analysis revealed a loss of perivascular AQP4 both prior to and after chronic epilepsy had developed. Together with an increase in AQP4 in active neuropil, this indicated a mislocalization of AQP4 that could contribute to epileptogenesis via deranged water and K+ homeostasis. Finally, in search of a possible biomarker of epileptogenesis we performed a manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) study from the early phase (two days) after kainate-induced status epilepticus to the chronic phase. In the mesial temporal lobes, there was a pronounced decrease in MEMRI signal in the early phase, with a partial recovery into the latent and chronic phases, except in CA1. A significant increase in MEMRI signal was detected in the entorhinal cortex and the amygdala in the chronic phase. We proposed that changes in manganese enhancement were likely to represent the net outcome of a number of processes, including level of neuronal activity, and that MEMRI yielded excellent contrast in structures that are central in epileptogenesis. Taken together, our studies show that the homeostatic functions of astrocytes are deranged in kainate-induced epileptogenesis, and further studies are warranted to resolve whether a decreased glutamate turnover on 13C MRS could, in the future, serve as a biomarker of epileptogenesis.