Genealogical, Clinical and Biochemical Studies in LRRK2 - associated Parkinson’s Disease

Abstract

Bakgrunn og målsetting

Parkinson’s sykdom (PS) er den nest hyppigste nevrodegenerative sykdom og rammer 1-2% av befolkningen over 65 års alder og kjennetegnes hovedsakelig av tremor, bradykinesi og rigiditet. Diagnosen PS er fortsatt basert på den kliniske undersøkelse da det ikke finnes noen pålitelige nevrokjemiske eller billeddiagnostiske markører. Man vet fortsatt lite om når og hvor sykdommen begynner, men man antar at sykdomsprosessen har pågått i mange år før de første symptomer blir synlige. Dette gjør det vanskelig å oppdage sykdommen i tidlig fase. Levodopa er fortsatt den mest effektive behandlingen, men etter noen år, når motoriske komplikasjoner tilkommer, kan dyp hjernestimulering (DBS) være nyttig. Årsaken til sykdommen er fortsatt ukjent, men mest sannsynlig spiller både miljø og arvelighet inn. En rekke genetiske faktorer er blitt beskrevet i løpet av de siste 10-15 årene, hvorav LRRK2 genet, spesielt p.G2019S mutasjonen, har den høyeste kliniske relevans. Denne mutasjon har den hyppigste forekomsten blant genetisk betinget PS og både kliniske og patologiske funn viser betydelig likhet med sporadisk PS pasienter. Man antar at bedre kjennskap til LRRK2-PS kan bidra til å forstå den basale sykdomsmekanismen til sporadisk PS.

Målet med denne avhandlingen var å kartlegge opphavet til norske Parkinson familier med LRRK2 mutasjon, beskrive dem klinisk, evaluere effekten av DBS og undersøke deres friske familiemedlemmer både klinisk og biokjemisk med tanke på tidlige sykdomsmarkører.

Materiale og metode

Over 600 Parkinson pasienter, 245 familiemedlemmer og 620 kontroll personer ble inkludert i studiene Genetisk screening. Alle Parkinson pasienter, inklusive 60 som ble operert med DBS, og kontroller ble testet for den hyppigste p.G2019S mutasjon i LRRK2 genet. Pasienter som hadde PS i familien ble ytterligere screenet for en rekke andre genetiske faktorer. Familiemedlemmene ble kun testet for den gitte mutasjonen som ble oppdaget i deres familie (Artikler I-V).Genealogisk studie. Slektsanamnese var gitt fra pasienter, deres pårørende og videre opplysninger var hentet fra Norsk Folkeregister, lokale kirkebøker og folketellinger. (Artikler I-II).Klinisk evaluering. Klinisk anamnese, komplett nevrologisk undersøkelse og UPDRS skjema var fylt ut hos alle Parkinson pasienter (Artikler I-II). Pasienter med DBS (n=60) fikk denne evalueringen før- og etter operasjon etter en bestemt tidsplan (Artikkel III). Friske familiemedlemmer til LRRK2 Parkinson pasienter (n=47) ble ytterligere undersøkt nevrologisk med UPDRS, i tillegg ble de testet for luktesans og fikk fylt ut spørreskjema med fokus på angst, depresjon, søvn, vannlating- obstipasjonsproblemer (Artikkel V).Metabolomics. Denne biokjemiske metoden ble foretatt i plasma fra pasienter som enten hadde LRRK2 - eller sporadisk PS, samt friske familiemedlemmer fra LRRK2-familier og kontroller (Artikkel IV).Biokjemiske analyser for å undersøke GTPase og kinase aktiviteten av Lrrk2 proteinet. Resultater Genetisk screening påviste den nye LRRK2 p.N1437H mutasjonen i 19 Parkinson pasienter (Artikkel II). LRRK2 p.G2019S mutasjon ble funnet hos 21 Parkinson pasienter fra ti forskjellige familier og i 44 av deres friske familiemedlemmer (Artikler I, V). LRRK2, PRKN, og PINK1 genmutasjoner ble funnet blant pasienter med DBS. De første to nevnte genmutasjoner hadde høyere forekomst hos de STN opererte enn blant de sporadiske PS pasientene (Artikkel III).Slektsforskningen viste at atten pasienter med LRRK2 p.N1437H mutasjon hørte til en stor fire-generasjons familie (Artikkel II). Seks av ti LRRK2 p.G2019S familier kunne tilbakeføres til felles stamforeldre (som levde omkring 1580-1650). To andre familier var inngiftet til denne storfamilien og de to siste familiene hadde samme haplotype, selv om det ennå ikke har vært mulig å knytte de genealogisk til storfamilien. Dette tyder på at alle opprinnelig stammer fra en felles far eller mor. Mutasjonen ble introdusert til Norge i middelalderen, sannsynligvis via en handelsmann fra Europa (Artikkel I).Den kliniske studien viste at LRRK2-PS er levodopa-responsiv parkinsonisme som debuterer i en gjennomsnittsalder av 61 år hos p.G2019S pasienter og noe tidligere, ved 48 års alder, ved N1437H-PS (Artikkel I-II). Pasienter med genetisk mutasjon, som ble operert med DBS, hadde like god effekt av operasjon som pasienter uten genetiske funn. De opererte mutasjonsbærere hadde ikke utviklet kognitiv svikt og etter >20 års sykdomsvarighet klarte de seg bra på egen hånd (Artikkel III).

Klinisk undersøkelse av friske familiemedlemmer viste at man ikke kunne forutsi en eventuell PS-relatert genetisk status basert kun på en klinisk evaluering. Likevel fant man en signifikant høyere motor score og kortere søvnlengde blant de som var bærere av en LRRK2 mutasjon sammenliknet med familiemedlemmer uten mutasjon. Mutasjonsbærere med høy motor score hadde også tydelig høyere score på angst og depresjonsskala, og rapporterte hyppigere vannlating og søvn problemer mens score på luktesans test var like (Artikkel V). Metabolomic studien av plasma viste en annen metabolittprofil hos pasienter enn hos kontroller. Den kunne skille mellom Parkinson pasienter med eller uten LRRK2 p.G2019S mutasjon. I tillegg var det en tydelig forskjell mellom mutasjonsbærere som hadde utviklet PS og de som ikke hadde sykdommen. De friske mutasjonsbærere kunne også skilles fra kontrollgruppen.Biokjemistudien viste at den nye LRRK2 p.N1437H mutasjonen var lokalisert på ROC domain i Lrrk2 proteinet, som førte til forhøyet GTPbinding og kinase aktivitet. Konklusjoner Genetisk screening påviste en ny mutasjon, p.N1437H i LRRK2 genet og genetisk betinget PS var overrepresentert blant DBS pasienter sammenliknet med den sporadisk Parkinson populasjonen.Genealogistudien viste at PS pasienter med LRRK2 p.G2019S mutasjon kunne føres tilbake til felles stamforeldre. Innenfor den store familien var det forskjeller ved at noen fikk sykdommen i yngre alder og ved at noen ikke utviklet symptomer selv i godt voksen alder. Man antar at miljøfaktorer kan spille inn og påvirke den varierende penetransen.Klinisk undersøkelse av friske familiemedlemmer kan avdekke tidlig sykdomstegn som kan tyde på en pågående sykdomsprosess, i forkant av diagnosen PS. Motor score kan være en ny preklinisk aspekt som bør vurderes og kan eventuelt vise seg å være mer pålitelig enn test av luktesans. Ved langt kommet sykdom, har DBS pasienter med LRRK2, PRKN og PINK1 genmutasjon like god effekt av operasjon som de sporadiske Parkinson pasienter. De viser ikke tegn til postoperativ kognitiv svikt noe som kan tyde på en bedre prognose. Metabolomic studien viste en annen metabolittprofil hos de friske mutasjonsbærere enn kontroller og pasienter med PS. Metabolittene som er ansvarlige for denne forskjellen er sannsynligvis i konstant forandring under sykdomsutviklingen. Ved identifisering av disse kan man eventuelt utvikle biomarkører for både tidlig diagnostikk og sykdomsprogresjon.Biokjemistudien viste forhøyet Lrrk2 kinase aktivitet hos LRRK2 p.N1437H pasienter hvor man hadde forventet, ut fra ROC domain funksjon, økt GTP-binding og GTPase aktivitet. Dette tyder på interaksjoner i diverse enzymaktiviteter i Lrrk2 protein.

Background and objectives

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder that affects 1-2% of the population aged over 65 years and is mainly characterized by tremor, bradykinesia and rigidity. The diagnosis of PD is still based on clinical evaluation since no reliable neurochemical or imaging markers exists. It is still unknown when and where the disease starts, however, the disease process has been most probably ongoing for many years when the first sign appears which makes early diagnosis challenging. Levodopa is still the most effective treatment of PD, though after some years when motor complications develop, deep brain stimulation (DBS) might be helpful. The etiology of PD is unclear, but both environmental and genetic factors are assumed to play a role. Numerous genetic factors have been described during the last 10-15 years, where the LRRK2 gene, especially the p.G2019S mutation, has the highest clinical relevance. This mutation is the most common cause of genetically determined PD and both the clinical and pathological findings overlap with sporadic PD. A better knowledge of LRRK2-PD is expected to help in understanding the basal mechanisms of sporadic PD. The aim of this thesis was to map the origin of Norwegian Parkinson families with LRRK2 mutations, describe them clinically, evaluate the outcome of DBS and examine their healthy family members both clinically and biochemically, searching for disease markers.

Materials and methods

More than 600 Parkinson patients, 245 family members and 620 controls were included in this thesis. Genetic screening. All Parkinson patients, included 60 who received DBS, and controls were tested for the most common p.G2019S mutation in the LRRK2 gene. Patients with familial PD were additionally screened for numerous other genetic changes. Most often family members were only tested for the given mutation found in their family (Paper I-V).Genealogic study. Family history was self-reported by the patients, or their family members, and additional data were obtained from the Norwegian National Registration Office, local parish registers and population censuses (Paper I-II).Clinical evaluation. Medical history, complete neurological examination, including UPDRS, was obtained in all Parkinson patients (Paper I-II). Patients who underwent DBS (n=60) had the same evaluation pre- and postoperatively according to a schedule (Paper III). Healthy family members of LRRK2-PD patients (n=47) were extensively examined neurologically including UPDRS and olfaction, and a questionnaire about anxiety, depression, sleeping, urinary- and constipation problems was filled out in each case (Paper V).Metabolomics. This biochemical method was applied to plasma from patients with LRRK2 and sporadic PD as well as healthy family members of the LRRK2 families and controls (Paper IV).Biochemical analyses were run for GTPase og kinase activity associated with Lrrk2 protein. Results Genetic screening identified a novel, LRRK2 p.N1437H mutation in 19 Parkinson patients (Paper II). The LRRK2 p.G2019S mutation was found in 21 patients from ten different families and in healthy family members (Paper I, V). LRRK2, PRKN, and PINK1 gene mutations were found in patients with DBS. The LRRK2 gene was overrepresented in the STN group compared to sporadic patients (Paper III).Genealogic studies identified 18 patients with the LRRK2 p.N1437H mutation belonging to a large four-generation PD-family (Paper II). Six of the LRRK2 p.G2019S families had a common ancestor couple living between 1580-1650. Two other families were linked to this large pedigree by intermarriage, and the remaining two families apparently had the same haplotype, even though they could not be connected genealogically to this pedigree. All these families lived along the coastline of central and northern Norway. These findings indicate that all the families originate from the same ancestor couple. The mutation was probably introduced to Norway in the Middle Ages through tradesman from Europe (Paper I).Our clinical studies have shown that LRRK2-PD is a levodoparesponsive parkinsonism with an average age at disease onset of 61years in patients carrying p.G2019S, and somewhat earlier, at age 48 years, in N1437H-PD (Paper I-II). Patients with genetic PD with DBS had as good an effect of surgery as patients without known genetic changes. In the genetic group no cognitive decline was observed and patients with disease duration >20 years managed their own everyday life (Paper III).

The PD-related genetic status of the healthy family members could not be predicted based on a clinical evaluation. Nevertheless, significantly higher motor scores and shorter sleeping hours were noted in LRRK2 mutation carriers compared to family members without any known mutation. Mutation carriers with high motor scores also had a higher score on the anxiety and depression scale, and urinary and sleeping problems were reported more often. Scores of smell test were similar in the two groups (Paper V). Metabolomic analysis of plasma showed different metabolite profiles in patients compared to controls. Sporadic PD could be separated from LRRK2 G2019S-PD based on the metabolomic profile. Additionally the healthy mutation carriers could be distinguished from both PD groups, and partly from the non-carriers.Biochemical studies showed that the novel LRRK2 p.N1437H mutation located in the ROC domain of Lrrk2, leads to enhanced GTP-binding and kinase activity. Conclusions  Genetic screening identified a novel p.N1437H mutation in the LRRK2 gene. Genetically determined PD was overrepresented in patients with DBS compared to the sporadic PD population.Genealogic studies of PD patients with the LRRK2 p.G2019S mutation provided empirical data for a common ancestor in Norwegian families. Various phenotype was described in this large pedigree, some with younger age at disease onset and some without any disease signs well over the average age at disease onset. Environmental as well as genetic factors are assumed to play a role in varying penetrance.Clinical examination of the healthy family members revealed early disease signs indicating an ongoing disease process prior to PD diagnosis. Motor scores may be another preclinical aspect that should be measured, and may even be a more reliable factor than olfaction, though these findings remain to be confirmed. In advanced PD, patients with DBS carrying LRRK2, PRKN og PINK1 mutations, have as good an effect of surgery as sporadic PD. Additionally no major cognitive impairment was noted in the mutation carriers postoperatively which might indicate a better disease prognosis. The metabolomic study showed different metabolomic profiles of the healthy mutation carriers compared to controls and patients with PD. The metabolites, responsible for the separation probably change during disease development. If they could be identified they might be suitable biomarkers for early diagnosis and for disease progression.Biochemical studies showed enhanced Lrrk2 kinase activity in LRRK2 p.N1437H patients even though increased GTP-binding with GTPase activity was expected in connection with function of the ROC domain. This indicates interaction between different enzyme activities in Lrrk2.