Francisella tularensis subspecies holarctica : Etablering av real-time PCR

Abstract

Tularemi forårsakes av den gram negative, kokkoide stavbakterien F. tularensis. F. tularensis har fire subspecies (ssp): ssp. tularensis (type A), ssp. holarctica (type B), ssp. novicida og ssp. mediasiatica.Type A forekommer i Nord-Amerika, mens type B finnes i Europa og Asia i tillegg til Nord-Amerika. Andre species i genus Francisella er F. philomiragia og F. piscicida. F. tularensis er en potensielt farlig mikroorganisme, som også er et fryktet agens for bioterrorisme. Rask diagnostikk er viktig, da komplikasjoner forekommer hyppigere ved sen oppstart av behandling. Dyrkning kan være krevende, og det er også fare for laboratoriesmitte. PCR er derfor en ønskelig diagnostisk metode. Når en prøve tester positivt med PCR for F. tularensis blir den testet videre med en PCR for F. tularensis subsp. tularensis, for å utelukke denne. Da det er subsp. holarctica som forårsaker tularemi i Norge er det hensiktsmessig med en PCR som kan si med sikkerhet at det er F. tularensis subsp. holarctica som er påvist bakterie.

Det finnes ikke fra tidligere en real-time PCR som kan skille subsp. holarctica fra de andre subspecies, og som er utprøvd i rutine i mikrobiologiske laboratorier. Målet med prosjektet var å utvikle en realtime PCR som ved HRM-analyse kan skille subsp. holarctica fra andre Francisella-stammer, og aller viktigst fra subsp. tularensis. HRM (High Resolution Melt)-analyse plasserer ulike PCR-produkt i ulike clustre, basert på smeltetemperatur og fasong på normalisert smeltekurve. Én SNP (Single Nucleotide Polymorphism) kan være nok til å kunne skille to produkt ved HRM-analyse.

Det ble i dette prosjektet selektert tre SNPer ut fra analyser gjort in silico. To av disse baserer seg på 23S rRNA-genet, mens den siste er i et gen som koder for et lipoprotein. 30 primerpar ble analysert, og 5 ble bestilt og testet med DNA fra tre dyrkede stammer, F. philomiragia, F. tularensis subp. tularensis og subsp. holarctica. To av primerparene ble også undersøkt videre med PCR for 25 ulike Francisella-stammer, og ekstrahert DNA fra 15 ulike pasientprøver med subsp. holarctica. Med det ene primerparet klarte man å skille F. tularensis subsp. holarctica fra F. philomiragia, F. piscicida og F. tularensis subp. tularenis, novicida og mediasiatica ved HRM-analyse. Ved PCR på pasientprøver ble 11 av 15 prøver clustret sammen med den positive kontrollen. Det andre primerparet fikk kun PCRprodukt for F. tularensis hvor man ved HRM-analyse kunne skille subsp. holarctica og novicida fra subsp. tularensis og mediasiatica. 13 av 15 pasientprøver ble her clustret sammen med den positive kontrollen.