Utprøving av suppresjon-subtraksjon-hybridiseringsmetodikk for genomisk sammenligning av to isolater av enteropatogene Escherichia coli

Abstract

Enteropatogen Escherichia coli (EPEC) er en av de hyppigste årsakene til gastroenteritter i utviklingsland. I disse landene dør flere millioner barn årlig av diaré. Den største dødeligheten hos spedbarn skyldes akutt diaré med kraftig dehydrering. Bakterier inneholder et spekter av ulike gener som bidrar til å gjøre dem patogene og vertsspesifikke. Genomet er svært dynamisk noe som fører til at det kan være betydelig genetisk variasjon innen en art, også innen EPEC-gruppen, og ulike virulensfaktorer kan ha betydning for om EPEC forårsaker sykdom eller ikke. Det er naturlig å anta at mange virulensfaktorer ennå ikke er kartlagt. Suppresjon-subtraksjon-hybridisering (SSH) har vist seg å være en nyttig metodikk til å finne faktorer i bakteriers aksessoriske genom, noe som kan ha betydning for deres evne til å forårsake sykdom. Formålet med denne oppgaven var å prøve ut en metode for sammenligning av bakteriegenomet til to utvalgte EPEC-stammer med SSH-metodikk med utgangspunkt i en kommersiellmetode (Clontech PCR-SelectTMBacterial Genome Subtraction Kit), samt å undersøke om det var mulig å etablere en kit-uavhengig metode for SSH-analyser.

SSH-metodikken ble utført i henhold til prosedyren for Clontech PCR med og uten bruk av kitet. SSH ble først utført med kitet for å se om dette var en egnet metode for de utvalgte stammene, og i tillegg for å ha resultater å sammenligne den alternative metoden med. For bruk i kit-uavhengig metodikk ble primere, adaptorer, polymerase og buffere tilsvarende reagenser i Clontech PCR-kitet bestilt uavhengig av kit-produsenten. Som et resultat av SSH av de to EPEC-stammene fikk man en blanding med sekvenser som ble klonet og sekvensert, og deretter analysert med Southern blot for å se hvor stor andel av de klonede sekvensene som var testerspesifikke.

Southern blot analyse viste at SSH både med og uten kit resulterte i tester-spesifikke fragmenter. Det var imidlertid flere trinn i SSH metoden hvor det krevdes betydelig optimalisering for å oppnå akseptable resultater, og det var ikke mulig å vurdere hvilken av de to metodene som ga flest testerspesifikke sekvenser grunnet metodologiske problemer ved kloning og sekvensering. Etablering av kit-uavhengig SSH-metodikk antas å være gjennomførbart men ville kreve omfattende videre utprøving og optimalisering. På grunn av rask teknologisk utvikling antas det at "high throughput" sekvensering i framtiden vil være en mer aktuell metodikk for sammenligning av bakterielle genomer enn SSH både på grunn av bedre sekvensdata og konkurransedyktig pris.

Enteropatogenic Escherichia coli (EPEC) are among the most frequent causes of gastroenteritis in developing countries. In these countries several million children die due to diarrhea annually. The highest mortality rate is among infants as a consequence of acute diarrhea with severe dehydration. Bacteria contain a broad range of different gene variants, which contribute in making the bacteria pathogenic and host-specific. The bacterial genome is very dynamic which means that there may be substantial genetic variation within a species, also within the EPEC-group. The different virulence factors determine whether bacteria have the potential to cause disease or not. It is realistic to assume that not all virulence factors have yet been discovered. SSH has been reported to be a useful method in the search for virulence factors in the accessory genome of bacteria that could be related to disease. The aim of this project was to test a method for suppression-subtraction-hybridization (SSH) analysis by comparing two selected EPEC-strains, based on a commercial kit (Clontech PCR-Select TM Bacterial Genome Subtraction Kit), and to test if it would be possible to establish a kit-independent method circumvent to the expenses of a commercial kit.

The SSH-methodology was carried out according to the Clontech PCR-method with and without the kit. SSH was first done with the kit to test if this was a suitable method to analyse the two selected strains, and also for later comparison with the kit-independent method. For use with the kit-independent method the primers, adaptors, polymerase and buffers were all identical with that in the kit, but were ordered separately. The resulting mixture of DNA fragments from SSH was cloned and sequenced, and thereafter analyzed by Southern blot to identify what proportion of fragments that were tester-specific sequences.

Southern blot analysis showed that both SSH without and with the Clontech kit resulted in tester specific fragments. However, several steps in the procedure demanded considerable optimalization for acceptable results, it was not possible to estimate which method that gave the highest number of tester-specific results due to methodological problems in cloning and sequencing of DNA fragments. Based on the experience gained in this study kit-independent use of the SSH method may be possible, but will require considerable further optimization. However, due to dramatic reduced costs and better data yield high-throughput sequencing may in the future be a more feasible method than SSH for comparative genome studies.