X-ray Repair Cross- Complementing protein 1: - the role as a scaffold protein in base excision repair and single strand break repair

Abstract

X-ray Repair Cross-Complementing protein 1 – en plattform for regulering av baseeksisjonsreparasjon og enkelttrådbruddsreparasjon DNA, vårt arvestoff, er et tilsynelatende stabilt molekyl satt sammen av to lange tråder bygd opp av fire forskjellige byggesteiner med fellesbetegnelsen baser. Rekkefølgen av basene angir en genetisk kode som overføres fra generasjon til generasjon. Arvestoffet er utsatt for påvirkning både fra cellens eget miljø og utenfra via kjemikalier eller stråling, og skader oppstår kontinuerlig. Dersom det oppstår skader som ikke repareres vil disse kunne føre til mutasjoner, arvelig sykdom, tidlig aldring eller ukontrollert celledeling – altså kreft. Det er derfor viktig for cellen, og oss som en hel organisme, at vi har mekanismer som kan reparere slike skader ved å gjenopprette korrekt baserekkefølge og dobbelttrådsstruktur. Dette kaller vi DNA reparasjon og fokus for denne avhandlingen er lagt til en av de viktigste DNA reparasjonsmekanismene, nemlig baseeksisjonsreparasjon (BER). BER er prinsipielt bygd opp av noen få trinn, hvor plattformproteinet XRCC1 blant annet er med på å organisere proteinene som fjerner en skadet base fra DNA, tilpasser trådbruddet slik at basen kan erstattes, fyller i en ny base og limer sammen trådene. XRCC1 er essensiell for embryonal utvikling og viktig for cellens forsvar mot spesifikke DNA-skader som oppstår spontant eller som er påført av kjemikalier. XRCC1 er ikke essensiell for BER, men det er vist at dette plattformproteinet er med på å effektivisere BER og enkelttrådbruddsreparasjon (SSBR). Prosessen hvor cellen kopierer sitt DNA før cellen deler seg, såkalt DNA replikasjon, er en kritisk fase. Korrekt DNA før DNA replikasjon er viktig slik at feil i baserekkefølgen ikke overføres til neste generasjon i form av mutasjon som i verste fall fører til kreft. Prosesser i cellen som DNA replikasjon og DNA reparasjon utføres av mange proteiner som samarbeider ved å danne kontrollerte bindinger til hverandre i såkalte proteinkomplekser. Koordineringen av proteinbindingene dirigeres ofte av spesifikke signalveier. Tidligere studier har satt spørsmål ved hvordan DNA reparasjonskompleksene organiseres ved skade på DNA. Det er foreslått at proteinene involvert i en skaderespons samles i reparasjonskomplekser først etter at DNAet er skadet.

I artiklene presentert i denne oppgaven går vi nærmere inn på hvilke proteinkomplekser XRCC1 er en del av. Vi har jobbet med forskjellige cellelinjer og utført kontrollerte eksperimenter både intracellulært og i reagensrør. Vi har påvist med stor sannsynlighet at XRCC1 inngår i flere typer reparasjonskomplekser avhengig av fase i cellesyklus og om cellen påføres DNA-skader eller ikke. Reparasjonskomplekser koblet til XRCC1 kan isoleres fra celler uavhengig av om cellene er påført DNA-skader eller ikke. Vi har også funnet at noen reparasjonskomplekser koblet til XRCC1 er assosiert med DNA replikasjonen og knytter dermed BER/SSBR til denne prosessen. Vi har påvist at reparasjonskomplekser koblet til XRCC1 ikke bare utfører innsetting av èn base (ènbase BER), men også utfører innsetting av flere baser (fler-base BER) dersom èn-base BER ikke kan fullføres. Uracil er en base som vanligvis oppfattes som en DNA skade da den indirekte kan føre til mutasjoner og enkelttrådbrudd. Et AP sete betegner et område i DNA hvor det mangler en base. Ved å bruke ei cellelinje som ikke uttrykker XRCC1 fant vi at XRCC1 er viktig for rask fullføring av BER med uracil som substrat, mens rask BER med AP sete som substrat er i større grad uavhengig av XRCC1.

Vi har påvist hvilke deler av XRCC1 som er nødvendig for at XRCC1 skal inngå i funksjonelle reparasjonskomplekser og fant at dette området også er viktig for å beskytte cellen mot DNA-skader påført av et alkylerende kjemikalie. Innenfor dette området av XRCC1 ligger tre forskjellige aminosyre-endringer (SNPer) som er relativt vanlige i enkelte befolkninger. Disse SNPene i XRCC1 har i epidemiologiske undersøkelser blitt knyttet til spesifikke krefttyper. Vi oppdaget at disse SNPene delvis påvirker XRCC1s evne til å forflyttes til og danne kompleks ved skadet DNA. De viser også en tendens til å svekke cellens evne til reparere påført skade. Slike endringer kan være nok til at DNA reparasjon knyttet til XRCC1 blir svekket slik at faren for kreft øker. Vi har i tillegg påvist at rekrutteringen av XRCC1 til et DNA skadet område påvirkes av en spesifikk signalvei og denne signalveien kan dermed knyttes til reguleringen av BER/SSBR.