Cytocompatibility and Functionalization of Nanocellulose for Bone Tissue Engineering Applications

Abstract

I denne masteroppgaven er overflateegenskaper til nanocellulosegeler som armering (scaffold) innenfor benvevsregenererings (BVR) applikasjoner utforsket. Nanocellulose er et materiale av stor interesse innenfor mange applikasjoner, der de mest ettertraktede egenskapene innenfor BVR inkluderer evnen til å danne sterke geler, porøse strukturer samt at nanocellulose er ikke-toksisk og kan unngå immunologiske reaksjoner in vivo.

2,2,6,6-Tetramethylpiperidinyloxy (TEMPO)-katalysert oksidering er en måte å introdusere karboksyl- og aldehyd-grupper på overflaten av cellulosefiber. TEMPO-oksidering er ansett som en lovende måte å tilpasse egenskapene til nanocellulosegeler. Et av hovedmålene med denne masteroppgaven var å evaluere effekten av aldehydgrupper introdusert på cellulose nanofibriller (CNF) ved TEMPO-katalysert oksidering, med fokus på cytokompatibiliteten til CNF i forbindelse med in vitro cellelevedyktighet, morfologi, vekst og osteogen differensiering. TEMPO-oksidert CNF uten aldehydgrupper ble produsert ved bruk av to ulike metoder; enten NaClO2-oksidering eller NaBH4-reduksjon. Cytokompatibilitetsstudiene ble utført ved å kulturere stamceller fra benmargen til rotter i kulturplate-brønner dekket med nanocellulose. Celler dyrket direkte i kulturplate-brønnene uten nanocellulose ble brukt som kontrollgrupper.

Et annet mål med masterprosjektet var å karakterisere nanocellulosematerialene som ble brukt i cytokompatibilitetsstudiet. En spektrofotometrisk metode ble brukt for å bekrefte ulikheter i aldehydinnhold for de tre CNF-prøvene produsert. I tillegg ble andre egenskaper med CNF-kvalitetene karakterisert, deriblant karboksylinnhold, fibrilleringsgrad, ζ-potensiale, kontaktvinkel og proteinadsorberingsegenskaper. En prøve med bakteriell nanocellulose (BNC) ble også inkludert i cytokompatibilitetsstudiene, for å ha mulighet til å sammenligne CNF-prøvene med et materiale som har vist gode egenskaper som scaffoldmateriale innenfor ulike vevsregenereringsapplikasjoner. Materialegenskaper for BNC-prøven ble derfor også evaluert.

Karakteriseringen av den TEMPO-oksiderte kvaliteten (TO-CNF), TEMPO-oksiderte og videre oksiderte kvaliteten (TO-O-CNF) og TEMPO-oksiderte og videre reduserte kvaliteten (TO-R-CNF) viste at verken TO-O-CNF eller TO-R-CNF inneholdt målbare mengder av aldehydgrupper. BNC-prøven inneholdt heller ingen spor av aldehydgrupper, mens TO-CNF-prøven inneholdt 280 ± 14 µmol aldehyd/g. Når det gjelder karboksyllinnhold hadde TO-O-CNF-prøven det høyeste innholdet (992 ± 24 µmol/g), etterfulgt av TO-CNF (804 ± 3 µmol/g) og TO-R-CNF (675 ± 14 µmol/g). TO-O-CNF-kvaliteten var betydelig mindre fibrillert i forhold til de to andre CNF-kvalitetene. ζ-potensialet til de tre CNF-kvalitetene i vann var tilsvarende hverandre, mens BNC-prøven hadde lavere ζ-potensiale. BNC-prøven hadde også lavere kontaktvinkel, målt med vann, i forhold til CNF-prøvene, samt dårligere proteinadsorberingsegenskaper når 10 % FBS i α-MEM medium ble brukt som proteinløsning.

Cytokompatibiliteten til CNF-kvalitetene med tanke på cellelevedyktighet og morfologi var tilsvarende hverandre, samt kontrollgruppen. Når det gjaldt cellevekst og celledifferensiering viste CNF-kvalitetene derimot dårligere egenskaper sammenlignet med kontrollgruppen. De tre CNF-kvalitetene viste totalt sett lignende egenskaper, noe som tyder på at fjerning av aldehydgrupper fra TEMPO-oksidert CNF har liten effekt. BNC-materialet viste ingen toksiske egenskaper, men sammenlignet med CNF-kvalitetene viste det seg at BNC-prøven hadde dårligere evne til å stimulere normal binding av cellene til BNC-overflaten, inkludert normal cellemorfologi. I tillegg stimulerte CNF-prøvene cellemineralisering i større grad enn BNC-prøven.

Det siste hovedmålet med masteroppgaven var å funksjonalisere TEMPO-oksidert CNF ved å kovalent binde, eller absorbere, β-cyklodekstrin (βCD). Motivasjonen for å oppnå βCD bundet til CNF er at βCD kan innkapsle andre molekyler som vekstfaktorer (VFer). Det kan sikre at VFer er tilgjengelig på vevsregenreringsområdet der scaffold-materialet er, som vil være nyttig ettersom VFer ofte kreves for å danne nytt vev. Å finne en metode for å oppnå βCD bundet til TEMPO-oksidert CNF ble ikke fullført. Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) indikerte βCD bundet til CNF-materialet etter enkelte behandlinger. Likevel bør andre metoder for å oppnå βCD bundet til CNF, samt andre metoder for å verifisere dette undersøkes.

In the following master thesis, surface properties of nanocellulose gels as a scaffold material were explored for bone tissue engineering (BTE) applications. Nanocellulose is a material of great interest within many applications, where attractive properties within BTE include the possibility of forming strong gels and porous structures, and more importantly, nanocellulose is non-toxic and non-immunogenic inside the human body.

2,2,6,6-Tetramethylpiperidinyloxy (TEMPO)-mediated oxidation is a way of introducing carboxylate and aldehyde functional groups on the surface of cellulose fibers. It is considered as a promising route to customize the properties of nanocellulose gels. One of the main goals for this master thesis was to evaluate the effect of the aldehyde groups introduced on cellulose nanofibrils (CNFs) by TEMPO-mediated oxidation, on the cytocompatibility of CNFs in regards to in vitro cell viability, morphology, proliferation and osteogenic differentiation. TEMPO-oxidized CNFs without aldehyde groups were obtained by two different treatments; either through NaClO2-oxidation or NaBH4-reduction. The cytocompatibility studies were performed by culturing rat bone marrow stem cells (rBMSCs) on nanocellulose coated tissue culture plates (TCPs) where cells cultured on uncoated TCPs were used as controls.

Another goal for this master thesis was to characterize the nanocellulose materials used for the cytocompatibility studies. A spectrophotometric method was used to confirm the differences in aldehyde contents for the three different CNF samples, in addition, other material properties were characterized, such as the carboxyl content, degree of fibrillation, ζ-potential, contact angle and protein adsorption properties. A bacterial nanocellulose (BNC) sample was also included in the cytocompatibility studies, in order to compare the CNF qualities towards a material which have shown good properties as a scaffold material for different tissue engineering applications. Material properties of the BNC sample were therefore also evaluated.

The characterization of the TEMPO-oxidized quality (TO-CNF), TEMPO-oxidized and further oxidized quality (TO-O-CNF) and TEMPO-oxidized and further reduced quality (TO-R-CNF) showed that neither the TO-O-CNF or TO-R-CNF samples contained detectable amounts of aldehyde groups. The BNC sample showed no traces of aldehyde groups either, while the TO-CNF sample contained 280 ± 14 µmol/g aldehyde groups. The TO-O-CNF sample contained the highest amount of carboxyl groups (992 ± 24 µmol/g), followed by TO-CNF (804 ± 3 µmol/g) and TO-R-CNF (675 ± 14 µmol/g). The TO-O-CNF quality was significantly less fibrillated compared to the other two CNF samples. The ζ-potentials of the three CNF qualities in water were similar to each other, while the BNC sample had a lower ζ-potential compared to the CNF qualities. The BNC sample also had a lower water contact angle compared to the CNF samples, in addition to poorer protein adsorption properties when 10 % FBS in α-MEM medium was used as a protein solution.

The cytocompatibility of the CNF qualities in regards to cell viability and morphology were similar to each other and to the control group. All CNF qualities supported limited cell proliferation and osteogenic differentiation when compared to the control group. However, they still showed similar properties to each other, which implies that it does not make a difference if the aldehyde groups are removed from TEMPO-oxidized CNFs. The BNC material was not toxic to the cells, however, the CNF samples provided a better surface for early cell attachment and morphology. In addition, the CNF qualities provided better surfaces for cell mineralization.

The last main goal was to functionalize TEMPO-oxidized CNFs by β-cyclodextrin (βCD) grafting. For clarification, grafting is used to describe either covalent or non-covalent binding of βCD to the CNFs. For nanocellulose scaffolds, growth factor (GF) availability at the site of tissue regeneration can be achieved by incorporating GFs in the scaffold material. This can be achieved by grafting the scaffold with βCD and further use the βCD to encapsulate other GFs. Determining a method to functionalize βCD to TEMPO-oxidized CNFs was not completed. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis could indicate the presence of grafted βCD after certain treatments. However, new grafting and verification methods should be tested.