Studie av forskjellige promotorer i den termotolerante metylotrofe bakterien Bacillus methanolicus

Abstract

Bacillus methanolicus er en termotolerant, metylotrof, Gram-positiv bakterie som har vist seg å gi høyt utbytte av aminosyrene glutamat og lysin ved overuttrykkelse av gener. Metylotrofi og toleranse mot høy dyrkningstemperatur gjør Bacillus methanolicus høyt ettertraktet i fremtidig bioteknologiske bruksområder ved å gjøre stor-skala kultivering økonomisk og miljøvennlig. Imidlertid er den dårlig utviklede genetiske verktøykassen en begrensende faktor for videre bruk av B. methanolicus i vitenskap, eller som en industrielt anvendelig mikroorganisme. I denne rapporten har et sett av mulige promotorsekvenser, oppdaget ved RNA-sekven- sering av Bacillus methanolicus MGA3, blitt studert. Promotorstyrken ble karakterisert enten ved bruk av et termostabilt, overfoldet grønt fluorescerende protein (sfGFP) eller et riboflavin-produserende operon som rapporteringsgener. Uttrykket fra elleve promotorsekvenser ble estimert og sammenlignet med den konstitutive og ofte brukte metanol dehydrogenasepromotoren (Pmdh) i platekulturer under flere kultiveringsbetingelser. Den antatte glutamat syntase promotoren (PgltAB) ble vist til å være konstitutiv og over dobbelt så sterk som Pmdh. Videre viste hexulose 6-fosfat syntase promotoren (Phps) en 15- ganger økning i riboflavinproduksjonen sammenlignet med PgltAB i mikrobioreaktorkulturer ved bruk av pBV2 som vektor og riboflavin operonet som rapporteringsgener. I tillegg ble fluorescerende proteinuttrykk funnet å være høyere i pBV2-plasmidet sammenlignet med pTH1-plasmidet, noe som motstrider tidligere transkriptomdata. Oppdagelsen av flere mulige promotorer i B. metanolicus med varierende styrke fungerer som en etterlengtet utvidelse av genomverktøyet, da det gir forskere flere muligheter i forskning på synteseveier, og letter videre utvikling av B. methanolicus som en biokatalysator i industriell produksjon.

Bacillus methanolicus is a thermotolerant, methylotrophic, Gram-positive bacteria that have been shown to produce high yields of amino acids by the over-expression of genes. The methylotrophy and tolerance towards high cultivation temperature make B. methanolicus highly relevant in future biotechnological applications by allowing large scale cultivations to be cost-effective and environmentally friendly. However, the poorly developed genetic toolbox is a limiting factor in further utilization of B. methanolicus in science, or as an industrially applicable microorganism. In this report, a set of putative promoter sequences discovered by RNA-sequencing of Bacillus methanolicus MGA3 has been studied. The putative promoter strengths were characterized either with the use of a thermostable, super folded green fluorescence protein (sfGFP) or riboflavin producing operon as reporter genes. The expression from eleven putative promoter sequences was estimated and compared to the constitutive, and widely used methanol dehydrogenase promoter (Pmdh) in microplate cultivations under multiple conditions. Putative glutamate synthase promoter (PgltAB) was shown to be constitutive, and over twice as strong as Pmdh. Further, putative hexulose 6-phosphate synthase promoter (Phps) depicted a 15-fold increase in riboflavin production compared to the putative PgltAB in microbioreactor cultivations using pBV2 as shuttle vector and riboflavin operon as reporter genes. Interestingly, fluorescent protein expression was found to be higher in the pBV2 plasmid rather than the pTH1 plasmid, conflicting previous transcriptome data. The discovery of multiple putative promoters in B. methanolicus with varying strengths serves as a much-needed expansion to the genetic toolbox as it increases the options researchers have in studying synthesis pathways, and facilitates the development of Bacillus methanolicus as a biocatalyst in industrial production.