Establishment of a Standardized Protocol and Assessing the Impact of Growth Phases for Persister Quantification

Abstract

Persister er en subpopulasjon av celler i en bakteriekultur som har lang levetid ved antibiotika behandling. Persisterne oppstår hovedsakelig fra to mekanismer: trigget og spontant. Triggede persistere er et svar på cellulær stress, mens spontane persistere antas å forekomme fra stokastiske hendelser. Flere tilnærminger til kvantifisering av persister har oppstått gjennom årene, og det har vært en del kontroverser med motstridende resultater publisert. Derfor er det nødvendig å etablere en optimal standardisert protokoll som alle kan bruke. I dette studiet har vi testet og modifisert en mye brukt protokoll. Persister kvantifisering ble utført fra kulturer dyrket i minimalt media i fermentor, hvor pH og nivå av oksygen ble holdt konstant. Kulturen ble behandlet med høye konsentrasjoner av antibiotika i komplett medium eller medium uten nitrogen for å isolere persisterene, og store forskjeller ble oppdaget. Behandling i media uten nitrogen resulterte i det høyeste antallet med persistere. Vi foreslår derfor at komplett medium skal brukes som standard for å studere variasjoner mellom forskjellige antibiotika og vekstfaser. Nitrogenfrie medier kan brukes til å oppnå maksimalt utbytte av persister celler når dette er nødvendig for videre analyser. Den nye protokollen kan brukes som en standard for kvantifisering av både trigget og spontant genererte persister i alle bakteriekulturer. Videre i dette Master-prosjektet ble både trigget og spontane persistere kvantifisert fra eksponentiell og stasjonær fase med Escherichia coli i M9 minimalt medium. Triggede persistere ble generert med karbon eller nitrogenbegrensning. Eksponentiell fase ga minst antall persistere, mens nitrogenbegrensning resulterte i høyeste antallet med persistere. Vi inkluderte også en ekstra analytisk prosedyre som besto av en endometabolomanalyse. Målet var å oppdage en eventuell sammenheng mellom gjennomsnittlig metabolsk status av kulturen og andelen persistere. Et omfattende panel av metabolitter ble analysert fra heterogene prøver av ikke-persistere og persister celler fra forskjellige vekstfaser. Endometabolomanalysen viste store forskjeller mellom de ulike vekstfasene og gir derfor verdifull informasjon. Nitrogenbegrensede celler var svært forskjellige fra de andre to vekstfasene i metabolom konsentrasjonene og dette var også vekstfasen med det høyeste antallet persistere. For videre studier foreslår vi at endometabolomanalyser skal inkluderes, og mer arbeid er nødvendig for å fullstendig forstå dette fagfeltet.

Persisters are a subpopulation of cells in a susceptible bacterial culture that have prolonged survival time during antibiotic treatment. The persisters origin mainly from two mechanisms: triggered and spontaneous. Triggered persistence is a response to cellular stress, while spontaneous persistence is presumably occurring from stochastic events. Several approaches to quantify persisters have emerged through the years and there has been quite some controversy with opposing results being published. Therefore, establishment of an optimal standardized protocol that everyone can use is needed. In this study, we have tested and modified a widely used protocol. Persister quantification was performed from cultures grown in minimal media in fermenters, where the pH and level of oxygen were kept constant. The cultures were treated with high concentrations of antibiotics in complete media or media without nitrogen to isolate the persisters, and large differences were discovered. Treatment in media without nitrogen resulted in the highest numbers of persisters. We therefore suggest that complete media should be used as a standard to study variations between different antibiotics and growth phases. Nitrogen-free media could be used to gain maximum yield of persister cells when this is needed for downstream analyses. The new protocol should be used as a standard for quantifying both triggered and spontaneously generated persisters in any bacterial cultures. Furthermore, in this Masters’ project both triggered and spontaneous persisters were quantified from exponential and stationary phase Escherichia coli in M9 minimal medium. Triggered persisters were generated with carbon or nitrogen limitation. Exponential phase resulted in the least number of persisters, while nitrogen-limitation resulted in highest number of persisters. We also included an additional analytical approach that consisted of an endometabolome analysis. The goal was to detect any potential link between average metabolic status of the culture and proportion of persisters. A comprehensive panel of metabolites were analyzed from heterogenous samples of non-persister and persister cells from different growth phases. The endometabolome analysis showed large differences between the different growth phases and bring valuable information. Nitrogen-limited cells were very different from the other two growth phases at the metabolome level, and this was also the growth phase with the highest number of persisters. For further studies we suggest that endometabolome analyses should be included, and more work are needed to completely explore this field of knowledge.